生信小白也能发SCI？看看Dr. Tom系统如何助力非编码RNA调控机制研究！
Dr. Tom多组学数据挖掘系统是一款无需深厚的生物信息学背景即可使用的数据分析及挖掘系统，在提供多种可视化工具、整合了多个公开数据库信息的同时简化了数据分析的过程，为科研用户提供更多的便利。
为了帮助您更好地使用Dr. Tom系统来挖掘数据潜力，本系列将通过每期精读1篇文献的方式，展示Dr. Tom在RNA-seq数据分析中的实际应用。
本系列中所有文献均引用Dr. Tom多组学数据挖掘系统，文章中部分图片由Dr. Tom系统绘制。
文章标题
Exosomal-miR-129-2-3p derived from Fusobacterium nucleatum-infected intestinal epithelial cells promotes experimental colitis through regulating TIMELESS-mediated cellular senescence pathway
期刊信息
研究背景
溃疡性结肠炎（UC）会增加肿瘤及其他肠外并发症的风险，因此，需要明确UC的发病机制，以有效控制UC进展，优化靶向治疗方案。已知具核梭杆菌（Fn）感染会加剧溃疡性结肠炎，然而，Fn感染的肠上皮细胞分泌的外泌体（Fn-Exo）与UC进展之间的联系尚未明确。本研究主要通过RNA-seq、免疫荧光印记实验、Western-blot，荧光素酶报告基因检测等技术手段，阐明Fn感染的细胞通过外泌体miRNA-129-2-3p调节TIMELESS介导的细胞衰老途径促进UC的分子机制。
实验设计及分析思路
首先，研究团队用Fn感染人肠上皮细胞，分离出外泌体，与没有感染Fn的细胞的外泌体进行细胞形态学的特征比较。
而后，研究团队用外泌体在体外和体内分别处理肠上皮细胞和小鼠，测定细胞理化特征及小鼠的病症表征，确定Fn感染细胞分泌的外泌体与肠炎的进展相关。
为了探究外泌体中哪个miRNA是关键分子，研究者进行了miRNA测序，筛选出目标miRNA。通过转染目标miRNA模拟物、目标miRNA抑制剂至肠上皮细胞，并提取外泌体，进行体内/体外实验，测定细胞理化特征及小鼠的病症表征，确定该miRNA为关键分子。
另外，对目标miRNA模拟物转染的上皮细胞进行转录组测序，鉴定目标miRNA靶向的mRNA，用qPCR、蛋白定量、RNA干扰，慢病毒载体等多种方法对mRNA和miRNA进行功能验证。
结果展示（部分）
01
外泌体特征鉴定
Fn感染的肠上皮细胞分泌的外泌体（Fn-Exo）的体积和密度都大于未经处理的肠上皮细胞分泌的外泌体（Con-Exo），且外泌体的marker蛋白CD63及CD9表达量更高。
02
体内&体外实验验证Fn-Exo对细胞屏障损伤与实验性结肠炎有促进作用
体外实验：将Fn-Exo或未感染Fn的肠上皮细胞分泌的外泌体（Con-Exo）与人结直肠癌细胞系细胞Caco-2进行共培养，外泌体会被细胞吸收。图b、c、d、e分别表示细胞跨上皮电阻、FITC标记葡聚糖的通透性、紧密连接蛋白ZO-1和封闭蛋白Occludin在不同处理中的变化。与Con-Exo相比，Fn-Exo共培养的细胞，细胞跨上皮电阻降低，葡聚糖通透性增加，连接蛋白ZO-1和封闭蛋白Occludin的表达均降低，标志着细胞屏障受损。
体内实验：将Fn-Exo、Con-Exo直接注射至结肠炎小鼠模型体内，观察小鼠病症。图f是小鼠的肠道长度，图h是不同组别小鼠的疾病活动指数DAI，图g是小鼠的体重的变化。可以看到FN-exo处理的结肠炎小鼠（DSS+Fn-Exo），其肠道长度缩短，DAI指数升高最为明显，小鼠体重减轻也最为明显。
结合体外、体内实验结果，证明Fn-Exo会使细胞屏障受损，并促进小鼠实验性结肠炎。
03
外泌体miRNA测序（Fn-Exo vs Con-Exo）
为了确定Fn-Exo中哪些具体基因引起了上述变化，进行外泌体miRNA测序。检测到了18个有显著差异的miRNA，图d是这18个基因的表达量热图。
选取了差异最显著的10个上调基因进行qPCR定量，仅有miR-129-2-3p在三种肠上皮细胞模型FHC，Caco-2和NCM460中均发生了显著的上调表达，与转录组测序的结果一致。
另外，对比了UC病人与健康人群的数据，miR-129-2-3p的表达量有显著的差异（图h）。进一步将UC病人分为Fn阳性的病人（Fn-high-UC）及Fn阴性的病人（Fn-negative/low-UC），miR-129-2-3p表达量在Fn阳性的病人中表达更高。
综上，miR-129-2-3p可作为UC的biomarker。
04
体内&体外实验验证miR-129-2-3p对细胞屏障损伤与实验性结肠炎的促进作用
将阴性对照RNA（Exo-NC）、miR-129-2-3p模拟物（Exo-mimics）、miR-129-2-3p抑制剂（Exo-inhibitor）及阴性对照RNA+miR-129-2-3p抑制剂（Exo-inhibitor-NC）与细胞共培养，分离出外泌体，进行体内、体外实验，结果同样表明，miR-129-2-3p的模拟物与Fn-Exo一样，会导致细胞屏障受损，促进实验性结肠炎。
05
转录组测序（miR-129-2-3p模拟物转染FHC vs 阴性对照FHC）
以人肠上皮细胞FHC作为对照组，转染miR-129-2-3p模拟物的FHC作为处理组，进行转录组测序，检测到823个有显著差异的mRNA。
用三种软件预测miR-129-2-3p的靶基因，并与得到的差异基因取交集，筛选出3个基因进行qPCR定量。其中只有TIMELESS在处理组中显著下调，且qPCR结果与转录组结果一致。
图f的蛋白定量结果也表明TIMELESS蛋白表达在处理组中下调。
而溃疡性结肠炎病人（UC）和健康人群（Control）相比，TIMELSS的表达量显著降低（图g）。进一步将溃疡性结肠炎病人分为Fn阴性（Fn-negative/low-UC）和Fn阳性（Fn-high-UC），Fn阳性的病人TIMELESS表达量更低（图i）。
图n是荧光素酶报告基因实验结果荧光素酶活性的变化。在miR-129-2-3p和TIMELESS的结合序列发生突变，二者无法结合后（Mutant），荧光素酶活性在各组间无明显差异，说明miR129-2-3p确实调控TIMELESS的表达。
06
Fn通过miR-129-2-3p/TIMELESS轴促进细胞衰老和DNA损伤
确定了溃疡性结肠炎与miR-129-2-3p/TIMELESS轴有关，那么究竟什么生物学功能受到了影响呢？
对转录组检测到的差异基因进行KEGG富集，发现细胞衰老通路是最显著富集的通路。
为了确认TIMELESS与细胞衰老的关系，比较不同处理的细胞中衰老相关的蛋白β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）、p53、p21、p16的含量。
siTIMELESS是TIMELESS敲降的细胞，这个则是敲降TIMELESS后有加入了miR-129-2-3p的抑制剂。从图b和图c中可以看到，衰老相关的蛋白在TIMELESS敲降的细胞（siTIMELESS）中表达量显著升高，而加入了miR-129-2-3p抑制剂（siTIMELESS+inhibitor）后，这种现象会被抵消，说明miR-129-2-3p/TIMELESS轴与细胞衰老相关。
H2AX和γH2AX是细胞DNA损伤的marker，图d可以看到TIMELESS敲降的细胞（siTIMELESS）中γH2AX含量增加，而加入了miR-129-2-3p抑制剂（siTIMELESS+inhibitor）后，这种现象会被抵消，说明miR-129-2-3p轴与DNA损伤有关。
07
TIMELESS通过ATM/ATR/p53通路调节细胞衰老
对富集到细胞衰老信号通路的17个基因绘制了PPI网络图，找到4个与其紧密相关的基因ATM、ATR、CHEK2、CHEK1（图a）。其中，ATM和ATR是DNA损伤的关键反应蛋白、磷酸化激活后，使检查点激酶CHEK2、CHEK1发生磷酸化，从而调节细胞衰老、细胞周期及其他细胞生物学过程。
Western blot结果显示ATM、CHEK2、ATR、CHEK1的磷酸化程度随着TIMELESS的表达量降低而升高（图b）。
为研究ATM和ATR的激活对于TIMELESS调节细胞衰老是否是必要的，将ATM抑制剂、ATR抑制剂及ATM/ATR共同抑制剂分别注射至FHC。发现β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例显著下降（图c）。因此认为ATM/CHEK2和ATR/CHEK1信号通路参与TIMELESS调节细胞衰老的过程。
当TIMELESS敲降后，磷酸化p53和p21的含量升高，且ATM、ATR抑制剂也会导致p53和p21的降低。
而p53信号通路的抑制剂（Pifithrin-α）的加入使得β-半乳糖苷酶阳性细胞比例减少，减缓因Timeless缺乏而导致的细胞衰老。
这些结果说明TIMELESS含量的降低会激活ATM、ATR和p53信号通路，从而调节细胞衰老。
08
Fn-exo通过miR-129-2-3p/TIMELESS轴激活ATM/ATR/p53通路，促进实验性结肠炎
构建了miR-129-2-3p海绵腺相关病毒载体（DSS+Fn-Exo+AAV-miR-sponge）和TIMELESS RNA干扰腺相关病毒载体（DSS+Fn-Exo+AAV-SHtimeless），并注射至小鼠体内。二者分别竞争性结合miRNA、使TIMELESS沉默，结果发现前者减轻结肠炎，后者则加剧结肠炎。
ATM/ATR/p53通路的相关蛋白pATM、p-ATR、p-p53表达在miRNA海绵小鼠中显著降低，而在TIMELESS沉默小鼠中显著升高，说明这些通路被miR-129-2-3p/TIMELESS周激活，从而促进小鼠结肠炎。
结论
具核梭杆菌感染的细胞，通过外泌体miR-129-2-3p/TIMELESS轴加剧细胞衰老和屏障损伤，从而促进小鼠实验性结肠炎。
科技君点睛
这篇文章结合了编码RNA和非编码RNA的测序数据，共同去解释具核梭杆菌促进结肠炎的分子机制。同时，采用了qPCR、Western blot、免疫荧光印记、荧光素酶报告基因检测、病毒转染、基因敲降等多种技术进行结果说明和验证，环环相扣，思路缜密，论据丰富。
本篇文章中，基因表达量热图、PPI网络图、富集分析气泡图、Venn图以及miRNA与mRNA的靶向关系预测均可使用Dr. Tom系统完成。
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文献链接：
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2023.2240035
供稿：鱼
编辑：市场部
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